Стаття про екзосоми, отримані з мезенхімальних стовбурових клітин жирової тканини людини
PLATINUM MED
Анотація
Екзосоми - це нанорозмірні везикули (30-200 нм), які постійно вивільняються майже всіма клітинами. Здатність екзосом переміщатися між клітинами і доставляти свій вантаж, який включає ліпіди, білки та нуклеїнові кислоти, робить їх привабливим варіантом безклітинної терапії для лікування багатьох захворювань. У цій роботі ми вперше дослідили, чи можуть екзосоми, отримані з мезенхімальних стовбурових клітин жирової тканини людини (ASC-екзосоми), покращити перебіг атопічного дерматиту (АД) на моделі мишей in vivo. При внутрішньовенному або підшкірному введенні мишам лінії NC/Nga, які отримували антигени кліщів домашнього пилу, ASC-екзосоми зменшували такі патологічні симптоми, як клінічна оцінка, рівень сироваткового IgE, кількість еозинофілів у крові, а також інфільтрацію тучних клітин, CD86+ і CD206+ клітин в уражених ділянках шкіри. ASC-екзосоми також значно знижували експресію мРНК різних запальних цитокінів, таких як інтерлейкін (IL)-4, IL-23, IL-31 та фактор некрозу пухлин-α (TNF-α) в уражених АД ділянках шкіри мишей лінії Nc/Nga. У сукупності ці результати свідчать про те, що ASC-екзосоми можуть бути новим перспективним безклітинним терапевтичним засобом для лікування БА.
Вступ
Оскільки сучасні методи лікування атопічного дерматиту (АД) обмежені та мають потенційно шкідливі побічні ефекти, існує незадоволена потреба в розробці нових методів лікування, які є безпечними та ефективними [1]. Кілька біологічних препаратів, спрямованих на прозапальні цитокіни, знаходяться на стадії розробки, а дупілумаб, подвійний інгібітор IL-4 та IL-13, нещодавно був схвалений FDA США для лікування дорослих з АД середнього та важкого ступеня тяжкості [1]. Хоча для визначення пізніх побічних ефектів дупілумабу необхідні довгострокові спостереження [1], його ефективність вказує на те, що множинне таргетування є вірогідним способом лікування БА [2].
Кілька досліджень продемонстрували, що алергічне прогресування БА може бути пригнічене мезенхімальними стовбуровими клітинами (МСК), отриманими з пуповинної крові людини (МСК пуповинної крові), кісткового мозку (МСК кісткового мозку) або жирової тканини (МСК жирової тканини) шляхом модуляції множинних мішеней [3]. Однак терапевтичне використання МСК має ряд недоліків, таких як низька ефективність приживлення, потенційне утворення пухлин, небажані імунні реакції, неспецифічна диференціація, короткий період напіврозпаду і складність контролю якості перед введенням [4].
Екзосоми - це нановезикули (30-200 нм), які виділяються майже всіма клітинами і містяться у всіх рідинах організму [4]. Екзосоми доставляють свій вантаж (білки, ліпіди та нуклеїнові кислоти) від клітин-джерел до клітин-реципієнтів. З'являється все більше доказів того, що екзосоми, отримані зі стовбурових клітин, можуть бути перспективною альтернативою клітинній терапії, оскільки екзосоми дозволяють уникнути більшості проблем, пов'язаних з клітинною терапією, при цьому повторюючи терапевтичну ефективність стовбурових клітин [4]. Наприклад, екзосоми не мають ризику утворення пухлин, оскільки вони не можуть реплікуватися. Вони також можуть бути стерилізовані шляхом фільтрації і мають довший термін зберігання, ніж самі клітини. Будучи набагато меншими за стовбурові клітини, екзосоми легко циркулюють в організмі і досягають місць ушкодження. Крім того, тривале повторне введення екзосом не викликає токсичності [5]. У цій роботі ми вперше дослідили терапевтичний ефект екзосом, отриманих з АСК людини (АСК-екзосом), на БА на мишачій моделі.
Кілька досліджень продемонстрували, що алергічне прогресування БА може бути пригнічене мезенхімальними стовбуровими клітинами (МСК), отриманими з пуповинної крові людини (МСК пуповинної крові), кісткового мозку (МСК кісткового мозку) або жирової тканини (МСК жирової тканини) шляхом модуляції множинних мішеней [3]. Однак терапевтичне використання МСК має ряд недоліків, таких як низька ефективність приживлення, потенційне утворення пухлин, небажані імунні реакції, неспецифічна диференціація, короткий період напіврозпаду і складність контролю якості перед введенням [4].
Екзосоми - це нановезикули (30-200 нм), які виділяються майже всіма клітинами і містяться у всіх рідинах організму [4]. Екзосоми доставляють свій вантаж (білки, ліпіди та нуклеїнові кислоти) від клітин-джерел до клітин-реципієнтів. З'являється все більше доказів того, що екзосоми, отримані зі стовбурових клітин, можуть бути перспективною альтернативою клітинній терапії, оскільки екзосоми дозволяють уникнути більшості проблем, пов'язаних з клітинною терапією, при цьому повторюючи терапевтичну ефективність стовбурових клітин [4]. Наприклад, екзосоми не мають ризику утворення пухлин, оскільки вони не можуть реплікуватися. Вони також можуть бути стерилізовані шляхом фільтрації і мають довший термін зберігання, ніж самі клітини. Будучи набагато меншими за стовбурові клітини, екзосоми легко циркулюють в організмі і досягають місць ушкодження. Крім того, тривале повторне введення екзосом не викликає токсичності [5]. У цій роботі ми вперше дослідили терапевтичний ефект екзосом, отриманих з АСК людини (АСК-екзосом), на БА на мишачій моделі.
Результати та обговорення
АСК-екзосоми виділяли методом послідовної фільтрації з безсироваткових кондиціонованих середовищ (Додатковий файл 1: Матеріали та методи) АСК та характеризували згідно з рекомендаціями Міжнародного товариства позаклітинних везикул (ISEV) [6]. За допомогою трансмісійної електронної мікроскопії та аналізу трекінгу наночастинок виявлено розподіл за розмірами та кількістю АСК-екзосом (Додатковий файл 1: Рис. S1A, B). Характеристики ASC-екзосом також були підтверджені за допомогою вестерн-блотингу з антитілами проти поверхневих маркерів (CD9, CD63 та CD81) та внутрішнього маркера (TSG101) (Додатковий файл 1: Рис. S1C). CD63 і CD81 були додатково проаналізовані за допомогою проточної цитофлуориметрії (Додатковий файл 1: Рис. S1D). Ми також використовували клітинний аналіз як аналіз потенції in vitro для ізольованих ASC-екзосом. Стимуляція клітин мишачих макрофагів RAW264.7 ліпополісахаридом (ЛПС) протягом 24 годин суттєво стимулювала продукцію оксиду азоту (NO). Однак сумісне застосування ASC-екзосом значно послаблювало продукцію NO в дозозалежний спосіб (Додатковий файл 1: Рис. S2). Примітно, що ефект ASC-екзосом був порівнянний з ефектом дексаметазону.
Щоб з'ясувати, чи покращують ASC-екзосоми симптоми AD in vivo, ми оцінили ефекти ASC-екзосом на мишачій моделі. АД-подібні ураження індукували кремом Біостир®-АД, що містить антигени кліщів домашнього пилу, у мишей NC/Nga (Додатковий файл 1: Матеріали та методи), а ASC-екзосоми вводили або внутрішньовенно (в/в), або підшкірно (п/к). ) тричі на тиждень протягом 4 тижнів (рис. 1а). Як позитивний контроль преднізолон (10 мг/кг) вводили перорально щодня. Ми виявили, що як внутрішньовенне, так і п/ш введення ASC-екзосом значно зменшувало симптоми БА дозозалежним чином (рис. 1б, в). Відповідно, товщина вух також зменшувалася у мишей, які отримували екзосоми ASC (рис. 1б, д). Ми також виявили, що кількість інфільтрованих опасистих клітин значно знижується при введенні ASC-екзосоми (мал. 1б, е та Додатковий файл 1 : рисунок S4). Крім того, після введення ASC-екзососоми у вогнищах ураження шкіри зменшувалася кількість CD86+ та CD206+ клітин (рис. 1б, е, ж, Додатковий файл 1 : Рисунки S5 та S6). Цікаво, що повідомлялося, що запальні дендритні епідермальні клітини (IDEC), які не виявляються в нормальній шкірі, але широко розповсюджені в шкірі з AD, експресують на своїй поверхні як CD86, так і CD206 [7, 8].
Щоб з'ясувати, чи покращують ASC-екзосоми симптоми AD in vivo, ми оцінили ефекти ASC-екзосом на мишачій моделі. АД-подібні ураження індукували кремом Біостир®-АД, що містить антигени кліщів домашнього пилу, у мишей NC/Nga (Додатковий файл 1: Матеріали та методи), а ASC-екзосоми вводили або внутрішньовенно (в/в), або підшкірно (п/к). ) тричі на тиждень протягом 4 тижнів (рис. 1а). Як позитивний контроль преднізолон (10 мг/кг) вводили перорально щодня. Ми виявили, що як внутрішньовенне, так і п/ш введення ASC-екзосом значно зменшувало симптоми БА дозозалежним чином (рис. 1б, в). Відповідно, товщина вух також зменшувалася у мишей, які отримували екзосоми ASC (рис. 1б, д). Ми також виявили, що кількість інфільтрованих опасистих клітин значно знижується при введенні ASC-екзосоми (мал. 1б, е та Додатковий файл 1 : рисунок S4). Крім того, після введення ASC-екзососоми у вогнищах ураження шкіри зменшувалася кількість CD86+ та CD206+ клітин (рис. 1б, е, ж, Додатковий файл 1 : Рисунки S5 та S6). Цікаво, що повідомлялося, що запальні дендритні епідермальні клітини (IDEC), які не виявляються в нормальній шкірі, але широко розповсюджені в шкірі з AD, експресують на своїй поверхні як CD86, так і CD206 [7, 8].
Малюнок 1
Терапевтична дія ASC-екзосом на БА-подібні ураження у мишей NC/Nga. а Протокол дослідження. b Репрезентативні шкірні прояви у мишей NC/Nga у дні 0 та 28, результати забарвлення H&E, результати забарвлення толуїдиновим синім та імуногістохімічне забарвлення клітин CD86+ або CD206+ у зразках шкіри вух від мишей AD. Збільшені зображення забарвлення толуїдиновим синім опасистих клітин та імунозафарбовування на CD86 і CD206 показано в Додатковому файлі 1: рисунки S4-S6 відповідно. Зазначені кількості ASC-екзосом (мікрограми/голову) вводили або внутрішньовенно, або підшкірно тричі на тиждень упродовж 4 тижнів. сВідносне відсоткове поліпшення клінічних показників тяжкості стану шкіри порівняно з групою носія. Відсоткове поліпшення розраховували, як описано в Додатковому файлі 1 : Матеріали та методи. d Збільшення товщини вуха, виміряне на зрізах тканин, забарвлених H&E, на b. д Кількість опасистих клітин у вогнищах ураження шкіри визначають на зрізах тканин, забарвлених толуїдиновим синім (б). Кількісний аналіз клітин CD86+ ( f ) і CD206+ ( g ), визначених у зрізах тканин на b . Результати подано як середнє значення ± стандартна помилка середнього; n = 10 для кожної групи. * Р < 0,05, ** Р < 0,01 і *** P < 0,001 порівняно з контрольною групою транспортного засобу. В/в внутрішньовенне введення, п/к підшкірне введення, преднізолон
Оскільки підвищення рівня IgE в сироватці корелює з тяжкістю хвороби Альцгеймера [ 9 ], ми досліджували вплив ASC-екзосом на рівень IgE в сироватці. Результати показали, що рівні IgE в сироватці помітно знижувалися після введення ASC-екзосом, внутрішньовенно або п/ш, дозозалежним чином, і ці ефекти були порівнянними з ефектами преднізолону (рис. 2а). Оскільки IgE опосередковує активацію опасистих клітин та еозинофілів [ 9 ], зниження рівня IgE в сироватці за допомогою ASC-екзосом може призвести до зменшення інфільтрації опасистих клітин (рис. 1е) та кількості еозинофілів. Як і очікувалося, ASC-екзосоми значно знизили кількість еозинофілів (рис. 2б), але практично не впливали на кількість нейтрофілів або лейкоцитів (додатковий файл 1 : рисунок S3).
Оскільки підвищення рівня IgE в сироватці корелює з тяжкістю хвороби Альцгеймера [ 9 ], ми досліджували вплив ASC-екзосом на рівень IgE в сироватці. Результати показали, що рівні IgE в сироватці помітно знижувалися після введення ASC-екзосом, внутрішньовенно або п/ш, дозозалежним чином, і ці ефекти були порівнянними з ефектами преднізолону (рис. 2а). Оскільки IgE опосередковує активацію опасистих клітин та еозинофілів [ 9 ], зниження рівня IgE в сироватці за допомогою ASC-екзосом може призвести до зменшення інфільтрації опасистих клітин (рис. 1е) та кількості еозинофілів. Як і очікувалося, ASC-екзосоми значно знизили кількість еозинофілів (рис. 2б), але практично не впливали на кількість нейтрофілів або лейкоцитів (додатковий файл 1 : рисунок S3).
Малюнок 2
Вплив ASC-екзосом на рівень сироваткового IgE, кількість еозинофілів та експресію прозапальних цитокінів у мишей NC/Nga. а Рівень сироваткового IgE визначали за допомогою ELISA. б Кількість еозинофілів у крові визначали шляхом диференціального підрахунку клітин. в - е. Виділяли тотальну РНК, а рівні мРНК IL-4 (в), IL-31 (г), TNF-α (д) та IL-23 (е) визначали за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі та нормалізували за експресією мРНК GAPDH. Результати подано як середнє значення ± стандартна помилка середнього; n = 10. * P < 0,05, ** P < 0,01 і ***P < 0,001 порівняно з групою транспортних засобів. В/в внутрішньовенне введення, п/к підшкірне введення, преднізолон.
Рівні мРНК запальних цитокінів аналізували за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі (qRT-PCR). Цікаво, що системне введення ASC-екзосом дозозалежно знижувало підвищені рівні мРНК IL-4, IL-31, IL-23 і TNF-α в ураженнях шкіри порівняно з контрольною групою; зниження було порівнянне з таким за лікування преднізолоном (рис. 2в-д). Фактично, всі ці прозапальні цитокіни є мішенями для біологічних препаратів, які наразі розробляють або нещодавно схвалено [ 1 ]. Зниження рівня цих численних мішеней добре корелює з полегшенням симптомів AD у цьому дослідженні, оскільки IL-4 ініціює перемикання ізотипового класу на IgE та активує еозинофіли [ 10 ]; IL-31 впливає на перемикання ізотипового класу на IgE і рекрутує запальні клітини в шкіру, а його рівень корелює з тяжкістю AD [ 11 ]; IL-23 індукує диференціювання наївних Т-клітин на високопатогенні Т-хелпери, які продукують TNF-α [ 12 ]; а концентрація TNF-α в плазмі корелює з важкістю БА [ 13]. У сукупності ці дані демонструють, що системне введення ASC-екзосом полегшує симптоми БА за допомогою регуляції запальних реакцій та експресії запальних цитокінів. Ці результати показують, що ASC-екзосоми можуть стати новою безклітинною терапевтичною стратегією лікування БА.
Незважаючи на актуальність наших результатів, обмеженням дослідження є те, що потенційну мінливість донорів ще належить враховувати. Фактично, звіт показав, що вік донора негативно впливає на імуномодулюючі властивості ASC [ 14 ]. Будуть потрібні подальші дослідження, щоб підтвердити, чи корелює ефективність ASC-екзосом у літніх донорів із нашими спостереженнями в молодших і здоровіших донорів.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6042362/
Рівні мРНК запальних цитокінів аналізували за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі (qRT-PCR). Цікаво, що системне введення ASC-екзосом дозозалежно знижувало підвищені рівні мРНК IL-4, IL-31, IL-23 і TNF-α в ураженнях шкіри порівняно з контрольною групою; зниження було порівнянне з таким за лікування преднізолоном (рис. 2в-д). Фактично, всі ці прозапальні цитокіни є мішенями для біологічних препаратів, які наразі розробляють або нещодавно схвалено [ 1 ]. Зниження рівня цих численних мішеней добре корелює з полегшенням симптомів AD у цьому дослідженні, оскільки IL-4 ініціює перемикання ізотипового класу на IgE та активує еозинофіли [ 10 ]; IL-31 впливає на перемикання ізотипового класу на IgE і рекрутує запальні клітини в шкіру, а його рівень корелює з тяжкістю AD [ 11 ]; IL-23 індукує диференціювання наївних Т-клітин на високопатогенні Т-хелпери, які продукують TNF-α [ 12 ]; а концентрація TNF-α в плазмі корелює з важкістю БА [ 13]. У сукупності ці дані демонструють, що системне введення ASC-екзосом полегшує симптоми БА за допомогою регуляції запальних реакцій та експресії запальних цитокінів. Ці результати показують, що ASC-екзосоми можуть стати новою безклітинною терапевтичною стратегією лікування БА.
Незважаючи на актуальність наших результатів, обмеженням дослідження є те, що потенційну мінливість донорів ще належить враховувати. Фактично, звіт показав, що вік донора негативно впливає на імуномодулюючі властивості ASC [ 14 ]. Будуть потрібні подальші дослідження, щоб підтвердити, чи корелює ефективність ASC-екзосом у літніх донорів із нашими спостереженнями в молодших і здоровіших донорів.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6042362/